Бактериологические методики
Бактериологическая диагностика.
1. Забор материала. Характер материала зависит от первичной или вторичной локализации микроба-возбудителя. Если материалом служат испражнения, что чаще всего бывает, то их берут до начала или после суточного перерыва в антибактериальной терапии. Материал лучше забирать ректальной трубкой, тампоном со стерильной пеленки или стерильной пергаментной бумаги, специальным устройством для забора фекалий (ни в коем случае не допуская его контакта с дезинфектантами). Если материалом служит кровь, то забирают 10,0 мл крови из вены локтевого сгиба.
2. Транспортировка материала осуществляется медицинским работником в системе "стекло, металл" в течение не более трех часов после его забора или в консерванте с сопровождающими документами.
3. Питательные среды, используемые для бактериологического исследования, можно подразделить на три группы:
A. Среды обогащения, создающие условия преимущественного размножения выделяемого возбудителя и основанные либо на принципе наличия в среде факторов активации роста данного микроба, либо на принципе подавления роста сопутствующих микробов-антагонистов. Первой группе соответствует среда Рапопорт, второй - селенитовая, магниевая, Мюллера, с пенициллином и т. д.;
B. Среды дифференциально-диагностические - плотные питательные среды, содержащие дифференцирующий углевод - лактозу и индикатор. Кишечные палочки, разлагающие лактозу (лактозоположительные), растут в виде окрашенных колоний в зависимости от типа среды - в малиново-красный и розовый (среда Эндо, Плоскирева) или темно-синий (среда Левина) цвет. Клебсиеллы пневмонии разлагают лактозу в среде с индикатором бромтимоловым синим и образуют колонии желтого цвета, в то время как колонии лактозоотрицательных биоваров формируют колонии цвета среды. Сальмонеллы и шигеллы на средах Эндо, Левина, Плоскирева также не разлагают лактозу и дают бесцветные колонии;
C. Среды накопления чистой культуры. Чаще применяется среда Олькеницкого (трехсахарный агар). Она состоит из столбика, скошенной части и включает лактозу, глюкозу и сахарозу, индикатор, реагенты для определения сероводорода и уреазы. Посев производят уколом в столбик и штрихом по поверхности скошенной части. При росте микробов глюкоза лучше разлагается в столбике, лактоза - на скосе, в результате чего дифференцированно меняется цвет среды. При образовании газа - формируются пузырьки и разрывы в среде, при продукции сероводорода - наблюдается почернение по ходу укола, при продукции уреазы - изменение цвета среды на оранжевый.
4. Идентификация выделенных культур основана на определении:
Ш Общего для семейства признака - грам - палочки;
Ш Наличия капсулы (у клебсиелл);
Ш Цвета колоний на чашечных средах;
Ш Подвижности (сальмонеллы и эшерихии подвижны, шигеллы и клебсиеллы неподвижны);
Ш Биохимических свойств;
Ш Антигенной структуры;
Ш Чувствительности к антибактериальным препаратам;
Ш Чувствительности к бактериофагам.
5. Антигенную структуру определяют по предварительному установлению серогруппы, чаще с монорецепторными адсорбированными сыворотками, а затем серовара тоже с адсорбированными сыворотками.
6. Серологическая диагностика: начинается с получения сывороток от больных. В них обнаруживаются антитела в реакции агглютинации, гемагглютинации, латекс-агглютинации или РСК. Диагноз основан на обнаружении антител в диагностическом титре или нарастании титра антител в динамике болезни. (5)
По данным автора (6) среди острых кишечных инфекций в настоящее время все большее значение приобретают заболевания, вызванные возбудителями, роль которых в патогенезе ОКИ у человека установлена сравнительно недавно. Среди них важное место занимает кампилобактериоз ввиду его широкой распространенности, постоянной тенденции к росту заболеваемости и наносимого им значительного социально-экономического ущерба. По данным ВОЗ, во многих зарубежных странах кампилобактериоз является наиболее частой этиологической формой в структуре ОКИ и в зависимости от региона на его долю приходится от 3 до 73 % всех острых кишечных инфекций. По инициативе ВОЗ изучение кампилобактериоза было включено в национальные программы по борьбе с диарейными заболеваниями примерно в 100 странах мира. Средние показатели заболеваемости кампилобактериозом в западных государствах, имеющих собственные системы биомониторинга, составляют 50 - 100 на 100 тыс. населения. В странах, где целенаправленный мониторинг отсутствует, статистические данные заболеваемости отличаются от реальной картины в несколько раз.
Кампилобактеры широко распространены в окружающей среде, среди животных и птиц. Они входят в состав как аллохтонной, так и аутохтонной микрофлоры. Среди кампилобактеров есть как представители нормальной микрофлоры, так и патогенные для животных и человека виды, вызывающие патологию репродуктивной сферы и диарейные заболевания.
Кампилобактериоз является серьезной проблемой для ветеринарной службы, так как это заболевание наносит значительный экономический ущерб животноводству. В настоящее время для его профилактики в неблагополучных районах используется вакцинация. Изучение кампилобактериоза в Российской Федерации начато с большим опозданием, что сопряжено с рядом причин: в первую очередь с трудностями и высокой стоимостью лабораторной диагностики, связанными с особенностями культивирования кампилобактеров, а также с разнообразием клинических проявлений заболевания и многообразием путей и факторов передачи возбудителей.
На данный момент кампилобактериозная инфекция, широко распространенная во всем мире, и по частоте выявления сопоставимая с сальмонеллезом, в РФ в практических лабораториях почти не диагностируется. Так, в 2002 г по всей России зарегистрирован 461 случай этой инфекции, показатель на 100 тыс. населения составил 0,32. Для сравнения за тот же период времени заболеваемость сальмонеллезом составила 49 480 и 34,27 соответственно. По данным литературы, до июля 2002 года на территории Липецкой области случаев заболевания кампилобактериозом зарегистрировано не было. Однако имелись предпосылки, указывающие на необходимость проведения микробиологического мониторинга возбудителя данной инфекции: стабильно высокий уровень заболеваемости острыми кишечными инфекциями, значительный процент ОКИ неустановленной этиологии, высокий уровень развития промышленного птицеводства на территории области, доступность продуктов птицеводства (основного фактора передачи кампилобактериоза) для различных слоев населения.
Благодаря внедрению бактериологической диагностики кампилобактериоза в лаборатории клинической инфекционной больницы, впервые в 2002 г. выявлены и зарегистрированы случаи кампилобактериоза на территории Липецкой области.
В период с 2002 по 2005 год проведено обследование 11607 больных обоего пола в возрасте от 1 месяца до 77 лет, госпитализированных в клиническую инфекционную больницу г. Липецка с симптомами острой кишечной инфекции.
В проводимых исследованиях использовали штаммы кампилобактеров, выделенные от обследованных больных (табл. 2), а также контрольные штаммы C.jejuni ATCC 11322 (диски Microtrol производства Becton Dickinson, США).
Материалом для исследования служили нативные фекалии больных, реже - содержимое прямой кишки, забранное с помощью ректальной петли. В случае невозможности своевременной доставки материала для исследования в лабораторию, он помещался в транспортную среду Кэри-Блер производства ЗАО НИЦФ г. Санкт - Петербург.
В качестве среды первичного посева использовали отечественную питательную среду кампилобакагар производства Государственного научного центра прикладной микробиологии г. Оболенск с добавлением аэротолерантных добавок: железа II сульфата и пирувата натрия.
Для выделения кампилобактеров применяли метод ядерных фильтров, имеющий ряд значительных преимуществ по сравнению с посевом на селективные питательные среды. Использовали фильтры с диаметром пор 0,46 и 0,55 мкм производства Объединенного института ядерных исследований г. Дубна. Отказ от внесения в среду селективных факторов (антибиотиков) способствовал сокращению срока выделения кампилобактеров до 24 часов инкубации (54,2% штаммов), возможности обнаружения разных видов кампилобактеров; росту возбудителя в чистой культуре, что значительно упрощало учет результатов посева.
Посевы инкубировали при температуре 42,0С в микроаэрофильных и капнофильных условиях в специальных системах для инкубации Genbox фирмы bio Merieux (Франция) с использованием газогенерирующих пакетов «Кампилогаз» производства ООО ИНКО г. Санкт - Петербург, предназначенных для создания искусственной атмосферы, обедненной кислородом и обогащенной углекислым газом. Состав искусственной атмосферы, генерируемой пакетом «Кампилогаз» в сосуде объемом 2,5-3 л: О2 - 5-7 % об., СО2 8-10 % об. Длительность инкубации составляла 48 часов с обязательным просмотром посевов через 24 часа.
Апробирована первичная идентификация колоний, подозрительных на кампилобактериозные, с использованием латексного агглютинационного набора Саmpylobacter test kit фирмы OXOID (Великобритания). Методика основана на взаимодействии латексных частиц тестовой поверхности, сенсибилизированных кроличьими кампилобактериозными антителами, с поверхностными антигенами отобранных клеток, подозрительных на кампилобактериозные.
Для видовой идентификация кампилобактеров использовали современные диагностические системы (стрипы) api Campy фирмы bio Merieux (Франция), позволяющие одномоментное проведение комбинации ферментативных и ассимиляционных тестов, а также тестов на чувствительность к антибиотикам.
Учет и интерпретацию результатов проводили визуально через 24 часа инкубации при 35-37 0С, сравнивая их с идентификационной таблицей.
Ни в России, ни за рубежом до настоящего времени не существует нормативного документа, четко регламентирующего процедуру определения и учет результатов чувствительности кампилобактеров к противомикробным препаратам. Французское общество микробиологов (SFM) и Британское общество антимикробной терапии (BSAC) дают лишь временные рекомендации, говоря о сложности проведения корреляции между МИК и диаметром зон задержки роста, NCCLS также не дает точных рекомендаций.
1. Кампилобактериозная инфекция занимает одно из ведущих мест в структуре ОКИ в Липецкой области. Показатель заболеваемости на 100 тысяч населения составил 1,46 в 2002 году и 3,34 в 2003 году. Максимальные показатели заболеваемости наблюдаются у детей первого года жизни - 147,6 на 100 тысяч населения и у детей 1-2 лет - 43,05 на 100 тысяч населения. Имеется сходство особенностей распространения данной нозологии с другими регионами РФ.
2. Штаммы кампилобактеров, выделенные в Липецкой области, имеют высокий уровень чувствительности к большинству тестируемых антибиотиков за исключением цефалоспоринов 1 поколения (цефалексин, цефазолин).
3. Совместное применение реакции коагглютинации в качестве сигнального скринингового экспресс-метода и бактериологического культивирования кампилобактеров существенно повышает эффективность микробиологической диагностики кампилобактериоза. (6)
По данным проведенных исследований группой авторов (4,5) установлено, что уровень заболеваемости ОКИ до настоящего времени остается довольно высоким и не имеет тенденции к снижению!!! Вместе с тем при ряде ОКИ (шигеллез Флекснер 2а, эшерихиоз 0157, клостридиоз) тяжесть течения болезни и число осложнений в последние годы возрастают и прогноз заболевания зачастую ухудшается. К сожалению, диагностика ОКИ во многих случаях является поздней, а число диагностических ошибок, по данным нашей клиники, за последние 20 лет достигает 12,2-14,7% и остается стабильным.
Главная причина диагностических ошибок - стремление врачей осуществить нозологическую диагностику, основанную на этиологической расшифровке заболеваний. Однако надо иметь в виду, что современный уровень бактериологических, вирусологических и серологических исследований не вызывает оптимизма.
По официальным данным, в квалифицированных лабораториях инфекционных больниц двукратное выделение монокультуры условно-патогенных бактерий из фекалий больных впервые 3 дня болезни удается в среднем в 50%, однократное - в 30% случаев.
При серологических исследованиях надо учитывать, что нарастание титра антител в сыворотке крови больного зависит не только от вида возбудителя, но в большей степени от реактивности организма и зачастую выражено незначительно или не имеет места.
Вместе с тем у постели больного необходима ранняя диагностика ОКИ, исключающая различные хирургические, терапевтические или иные соматические заболевания, имеющие сходную симптоматику. При этом этиологическая расшифровка ОКИ не нужна, так как этиотропная (антибактериальная) терапия при подавляющем числе этих заболеваний (за исключением шигеллеза) не проводится или носит вспомогательный характер.
Этиологическая расшифровка в основном определяется необходимостью проведения противоэпидемических мероприятий и осуществляется в трех ситуациях:
Ш при подозрении на холеру;
Ш при групповых вспышках ОКИ;
Ш при внутрибольничной инфекции.
В этих случаях необходимо проведение углубленных эпидемиологических, бактериологических и серологических исследований. К сожалению, для неотложной диагностики ОКИ малоинформативны инструментальные исследования (ректороманоскопия, колоноскопия, ирригоскопия).
Ранняя диагностика ОКИ должна носить синдромальный характер с целью выявления симптомов, свойственных синдромам интоксикации и обезвоживания. Только при этом может быть обеспечено: снижение числа диагностических ошибок и своевременное и адекватное проведение неотложной патогенетической терапии. На протяжении последних 20 лет летальность при ОКИ не снижается. Причин этому несколько:
v большое количество диагностических ошибок (12,2-14,7%);
v изменение социального состава больных (среди умерших 60% страдали хроническим алкоголизмом, более трети лица социально не защищенные);
v смена циркулирующего серовара шигелл (Flexner 2a);
v патоморфоз ОКИ - увеличение числа случаев с глубоким поражением кишки и развитием перитонита. В нашей клинике летальность при пищевых токсикоинфекциях и сальмонеллезах составляет 0,1% , а при шигеллезе - 1,4%.
Для снижения летальности при ОКИ необходимы:
v ранняя госпитализация в инфекционные стационары тяжелых и среднетяжелых больных, а также социально неустроенных лиц при любой тяжести болезни;
v адекватная регидратационная терапия;
v рациональная этиотропная терапия шигеллеза с использованием цефалоспоринов II-III поколения и фторхинолонов, особенно при тяжелом течении болезни;
v раннее выявление осложнений: инфекционно-токсический шок (ИТШ),
v ДВС-синдром, острая почечная недостаточность (ОПН), пневмония и т.д.;
v выявление и адекватное лечение сопутствующих заболеваний;
v при возникновении у больных неотложных состояний (ИТШ, ДВС-синдром, респираторный дистресс-синдром, энцефалопатия, ОПН, нестабильная гемодинамика) своевременный перевод больных в реанимационное отделение.
Таким образом, ОКИ - это большая группа полиэтиологичных заболеваний, протекающих с синдромами поражения желудочно-кишечного тракта, интоксикации и обезвоживании различной степени выраженности.
Диагностика ОКИ должна быть синдромальной, а не этиологической (за исключением холеры и шигеллеза).
Диагностические ошибки при ОКИ в значительной мере объясняются общностью клинической симптоматики со многими соматическими заболеваниями (острый аппендицит, кишечная непроходимость, инфаркт миокарда, внематочная беременность, декомпенсированный сахарный диабет и др.).
Основу лечения ОКИ составляет регидратационная терапия полиионными кристаллоидными растворами, осуществляемая перорально или внутривенно. Лечение осложненных форм ОКИ (ИТШ, ДВС-синдром, РДСВ, ОПНи др.) во многих случаях должно осуществляться в условиях реанимационных отделений. (7,8)
кишечный инфекция возбудитель
Бактериологический метод включает бактериоскопию материала от больного, выделение чистой культуры возбудителя и его идентификацию с определением чувствительности к антибиотикам и химиопрепаратам.
Выбор материала
для исследования бактериоскопическим методом зависит от предполагаемой этиологии заболевания, стадии болезни с учетом ее патогенеза, биологических свойств возбудителя и других моментов.
1. При инфекционных болезнях
, протекающих с бактериемией (брюшной тиф, генерализованные и септические формы сальмонеллеза); при сепсисе любой этиологии, вызываемом не только гноеродной кокковой микрофлорой, синегнойной палочкой, но и более редкими ее возбудителями (Serratia Salinaria, неферментирующие бактерии, анаэробы, L-формы стрептококка (метод Сукнева) и другие микроорганизмы), прибегая в этих случаях к посевам на специальные питательные среды. Следует подчеркнуть, что успех частоты и спектр выделяемых возбудителей из крови и других биологических секретов больного зависят от эрудиции, пытливости, настойчивости и упорства работников бактериологической лаборатории.
2. Спинномозговая жидкость (гнойные менингиты; туберкулезный менингит при длительном выращивании (более месяца) на специальных для выделения туберкулезных бактерий питательных средах.
3. Мокрота (острые пневмонии и трахеобронхиты, туберкулез, коклюш, чума, редкие формы брюшного тифа (пневмотиф), легионеллез, респираторный микоплазмоз и хламидиозы).
4. Слизь, гной с миндалин (стрептококковые и стафилокковые ангины).
5. Налет и слизь с миндалин
, из зева и носа, отделяемое с конъюнктивы, половых органов (дифтерия).
6. Соскоб со слизистой носа (проказа).
7. Отделяемое из носа и ротоглотки (синуиты, озена, риносклерома).
8. Отечная жидкость, кусочки пораженных мышц, некрозированные ткани (анаэробные инфекции); отделяемое ран (ботулизм; в случае необходимости и столбняк).
9. Пунктат из увеличенных лимфоузлов (туберкулез, токсоплазмоз).
10 Содержимое карбункула и пунктат из нагноившихся лимфоузлов (чума, туляремия, септикопиемия, сибирская язва).
Бактериологические исследования при особо опасных инфекциях (чума, туляремия, бруцеллез, холера (при которой исследуются только испражнения(!)) выполняются в специальных режимных лабораториях, исключающих возможность самозаражения ее сотрудников при работе с бактериальными культурами и распространение возбудителей за пределы этих лабораторий.
Серологические исследования . Внедрены в клинику несколько позднее бактериологического метода, предложенного Р. Кохом. В 1896 г. Ф. Видаль обнаружил, что сыворотки крови больных брюшным тифом к концу 1-й недели болезни приобретают способность агглютинировать брюшнотифозную палочку - возбудителя брюшного тифа (положительная реакция Видаля). При полимикробной этиологии инфекционных болезней после открытия Видаля стали также прибегать к определению титров сывороточных агглютининов к выделяемым из патологического материала нескольким видам бактерий (реакция аутовидаля) и контролировать их динамику в зависимости от стадии болезни. Наиболее высокие титры агглютининов к одному из видов выделенных бактерий свидетельствуют в пользу его большей этиологической причастности к развитию болезни.
Уже в начале применения реакции Видаля в клинике было замечено, что самые тяжелые формы, например, брюшного тифа могут протекать при отсутствии в крови агглютининов (отрицательная реакции Видаля), что указывает на относительную диагностическую ценность этого метода как при брюшном тифе, так и при других инфекционных болезней. Позднее он был заменен более чувствительными серологическими методами. Но приоритетное значение открытия Видаля останется навсегда.
В настоящее время для серологической диагностики бактериальных инфекций применяют более чувствительные методы, когда антиген бактерий сорбируют на поверхности эритроцитов (эритроцитарные диагностикумы1). Таким образом, были разработаны принципиально новые серологические реакции: прямой (РПГА) и непрямой гемагглютинации (РИГА). Они широко применяются для серологической диагностики многих бактериальных, вирусных и других инфекций (брюшного тифа, сальмонеллеза, шигеллезов, бруцеллеза, туляремии и др.). Сохраняет свое диагностическое значение реакция преципитации при некоторых заболеваниях (ботулизме и сибирской язве - реакция Асколи для ее диагностики у животных). В серодиагностике особенно широко в настоящее время применяется реакция связывание комплемента (РСК), предложенная в 1901 г. французскими исследователями Борде и Жангу (сифилис, гонорея, бруцеллез, токсоплазмоз, туберкулез, проказа, сап). РСК имеет наибольшее значение для серодиагностики вирусных инфекций (грипп, другие ОРВИ, герпес, энцефалит, эпидемический паротит, орнитоз и др.), а также многочисленных риккетсиозов.
Бактериологический метод исследования патматериала на предмет выделения и идентификации микобактерий включает 3 способа: бактериоскопический, культуральный и биологический / Р.В.Ткзова, 1983; И.И.Румачик, 1987,1993; А.С. Донченко, 1989; Ю.Я. Кассича, 1990; А.Х.Найманов, 1993; Л.П.Ходун, 1997/. Срок бактериологического исследования не должен превышать 3-х месяцев.
Учитывая, что макроскопические туберкулезные изменения в органах и тканях крупного рогатого скота вызывает возбудитель туберкулеза бычьего вида, исследовать такой материал бактериологически не имеет смысла. Если такой материал доставлен в лабораторию для исследования, то производят комиссионный осмотр и составляют акт. Материал обезвреживают.
Бактериоскопическое (микроскопическое) исследование материала заключается в приготовлении из каждого органа (или кусочков органа с подозрительными на туберкулез изменениями) и лимфатического узла, доставленных для исследования, по 2 мазка-отпечатка, высушивании их на воздухе, фиксации над пламенем спиртовки, окрашивании по Циль-Нильсену и просмотре окрашенных мазков под микроскопом, причем не менее 50 полей зрения в каждом мазке. Необходимо приготовить, как минимум, 20 мазков-отпечатков из материала от одной туши. Кроме того, мазки для микроскопии готовят также и из высеваемой на питательные среды взвеси материала.
Окраска мазков по Цилю-Нильсену является избирательной на выявление микобактерий: на синем фоне окрашенных тканей или посторонней микрофлоры микобактерии просматриваются как красные, розовые или рубиново-красные палочки. Лучше всего просмотр мазков вести под микроскопом-бинокуляром при увеличении 1,5 (насадка) х 7 (окуляр) х 90 или 100 (объектив).
Способ используют как сигнальный, поскольку наличие или отсутствие микобактерий в мазках абсолютно не влияет на ход дальнейших исследований и даже положительное заключение бактериоскопии не имеет юридической значимости (кроме птиц). Материал необходимо исследовать далее.
Лабораторный диагноз на туберкулез у птиц считают установленным, если из исследуемого материала выделена культура микобактерий птичьего вида (от попугаев - человечьего или птичьего видов), получен положительный результат биопробы, а также при обнаружении микобактерий в мазках из патологического материала при микроскопическом исследовании (п. 7.3.2. наставления).
Необходимо обратить внимание также и на то, что на приготовление мазков-отпечатков, их фиксацию и просмотр уходит очень много времени, а обнаружить в них микобактерии удается очень редко, даже в мазках из высеваемой взвеси материала. Поэтому в целях экономии рабочего времени и средств при исследовании материала от животных, не имевших изменений при убое, целесообразно ограничиться приготовлением и просмотром мазков только из высеваемой на питательные среды взвеси материала. Это не приведет к ущербу в диагностике туберкулеза, ведь исследование материала продолжается далее.
Кроме обычной световой микроскопии можно использовать люминесцентную микроскопию. Мазки готовят аналогичным образом, фиксируют и окрашивают смесью флуорохромов. Окрашенные мазки просматривают под люминесцентным микроскопом. Способ более чувствителен, однако менее специфичен, и поэтому мало приемлем, особенно в условиях практических лабораторий.
Культуральное выделение микобактерий на питательных средах является одним из важных звеньев в лабораторной диагностике туберкулеза на современном этапе. Однако питательные среды, на которые был высеян материал (на 5-10 пробирок в соответствии с наставлением), в первые 2-3 недели имеют частичный или полный пророст, как правило, из-за нарушения стерильности при посеве материала. Посевы выбраковываются как раз в тот период, когда вероятнее всего проявление первоначального роста атипичных микобактерий (не говоря уже о проявлении первоначального роста возбудителя туберкулеза, который проявляет рост еще позже). В таких случаях культуральный способ выделения микобактерий на питательных средах механически выпадает. Это одна из основных причин получения отрицательных результатов при бактериалогическом исследовании материала. В результате, не получив роста колоний микобактерий на питательных средах после посева материала, а лабораторные животные остались живы в течение 3-х месяцев, следует стандартный ответ лабораторий: «Возбудитель туберкулеза не выделен» или «Экспертиза материала на туберкулез отрицательная». На основании результатов проведенных исследований причина реагирования крупного рогатого скота на туберкулин не установлена, и это ведет к дальнейшему необоснованному убою значительного количества реагировавших на туберкулин животных в хозяйствах, благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, что наносит большой экономический ущерб, нарушает оборот и воспроизводство стада.
Учитывая вышеизложенное, необходимо первоочередное внимание уделять культуральному способу выделения микобактерий из материала на питательных средах, как самому слабому звену в бактериалогической диагностике туберкулеза в районных ветеринарных лабораториях.
Положительные результаты культурального метода выделения микобактерий зависят, в основном, от двух обстоятельств: увеличение достоверности высева микобактерий из материала и соблюдение условий стерильности при работе в боксе.
Увеличение достоверности высева микобактерий из взятого для исследования материала зависит, в первую очередь, от качественного его отбора, предпосевной обработки и увеличения количества пробирок среды, на которого производят посев.
Основные условия, соблюдение которых при посеве материала на питательные среды гарантирует получение рост колоний микобактерий:
а) отбирать материал для бактериологического исследования от убитых животных, не имевших изменений при убое, отдельно от каждой туши и высевать на 10-20 пробирок среды каждую пробу (материал от каждого животного) по следующей схеме:
Лимфатические узлы головы (подчелюстные, заглоточные);
Бронхиальные и средостенные лимфатические узлы;
Мезентериальные (брыжеечные) лимфоузлы;
Прочие лимфоузлы (при наличии подозрительных участков);
Органы (тоже при необходимости).
В результате получается посев материала от одного животного на 30-50 пробирок среды. Этим достигается увеличение достоверности высева микобактерий в 3-5 раз, так как без разделения проб (по наставлению) высев материала рекомендуется проводить всего на 5-10 пробирок среды от двух голов одной фермы.
б) Непосредственно при бактериологическом посеве материала вырезать кусочки с нарушенной морфологической структурой лимфатического узла или органа (гиперплазия, уплотнение, точечные и полосчатые кровоизлияния и т.д.). Причем необходимо вырезать все измененные участки. Если материала по объему получается много в одну ступку, то его можно разделить в две.
в) Строго соблюдать взятую для работы методику, не нарушая режим обработки и высева материала.
г) При гомогенизации материала, особенно лимфатических узлов, необходимо использовать стерильный песок или мелкобитое стерильное стекло. Максимально растирать материал (до сметанообразной консистенции) для лучшего извлечения микобактерий из исследуемого материала
д) Добавлять физраствор к гомогенизированному материалу в ступку в количестве, необходимом для высева взвеси материала на питательные среды и для биопробы (в среднем до 0,5 см3 в одну пробирку и 1 -2 см3 для подкожного заражения одной морской свинки). Это количество физраствора можно рассчитать заранее.
е) Просмотр посевов материала проводить через 3, 5, 7, 10, 15 дней и в дальнейшем один раз в неделю.
ж) Любая выросшая на среде колония микроорганизмов (типичная или атипичная, пигментная или беспигментная, слизистая или суховатая и т.д.) должна пройти микроскопию при избирательной окраске по Циль-Нильсену.
Следует обратить внимание на степень отмывки материала от кислоты (или щелочи), применяемой для обработки материала от контаминации посторонней микрофлорой. Остаточное количество кислоты всегда будет присутствовать во взвеси из высеваемого материла, однако оно должно быть минимальным. Показателем этого служит восстановление первоначального цвета среды на 2-4-ый день после посева материала. Если цвет среды не восстановился, это свидетельствует о повышенном количестве остаточной кислоты. Цвет среды приобретает синеватый оттенок различной интенсивности. Рост (предполагаемых) микобактерий в данном случае замедляется, либо его не будет вообще, особенно возбудителя туберкулеза как более требовательного к режиму культивирования. Остаточное количество кислоты действует на микобактерии в некоторой степени бактериостатически.
Для герметизации пробирок после посева материала можно применять ватные и ватно-марлевые пробки с последующей заливкой их парафином, резиновые без- и резиновые с вырезанным косым желобком, корковые и металлические пробки (затворы).
При определении видовой принадлежности выделенной культуры микобактерий известно много (около 300) различных тестов: культурально-морфологические, биологические, биохимические, серологические, определение лекарственной устойчивости и т.д. Однако в ветеринарной практике применяется их минимум (см. наставление). Для лабораторий достаточно определение выделенной культуры микобактерий следующих видов: бычий, человечий и птичий, что определяется биопробой, а атипичные микобактерии - разделить на группы по Runyon (1959): I - фотохромогенные (образующие пигмент под воздействием света), II - скотохромогенные (образующие пигмент независимо от воздействия света - и в темноте, и на свету), III - нехромогенные (не образующие пигмента) или еще их называют беспигментные (сюда же отнесен и возбудитель туберкулеза птичьего вида), IV - быстрорастущие микобактерии и кислоустойчивые сапрофиты.
Для этого достаточно эффективно и экономически оправдано изучение свойств выделенной культуры по сокращенной схеме, в которой основное внимание уделяется срокам появления первичного роста колоний, пигментообразованию, культурально-морфологическим и тинкториальным свойствам при окраске по Цилю-Нильсену. Особенно значим тест на корд-образование в первичной или даже в субкультуре в сочетании с результатами биопробы. Для приготовления мазков из выросших колоний целесообразно одновременно делать их как из колоний, так и из остатков взвеси и конденсата, т.е. с жидкой части на дне пробирки.
Кроме того, сотрудники лабораторий имеют возможность не только проводить контрольный убой реагировавших на туберкулин животных и отбирать пробы материала для исследования, но и отбирать для бактериологического исследования при жизни животных (бронхиальная или носовая слизь, молоко, фекалий, моча, экссудат, кровь и т.д.), а также пробы кормов, воды, объектов внешней среды на предмет выделения микобактерий и, таким образом, косвенно доказывать причину реагирования скота на туберкулин. При посеве дополнительного материала и проб из объектов внешней среды используют общеизвестные методы концентрирования микобактерий: седиментационный, флотационный, флотационно-седиментационный и другие.
Сокращенная схема дифференциации микобактерий с использованием биопробы
Диагностика инфекционных заболеваний является одной из самых сложных проблем в клинической медицине. Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания.
Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.
Сеть независимых лабораторий «Ситилаб» в своей работе для диагностики инфекционных заболеваний использует 3 группы специальных лабораторных методов исследования:
- бактериологические;
- серологические;
- метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК или РНК возбудителя инфекционного заболевания в исследуемом материале.
У одних пациентов для диагностики этиологии инфекционно-воспалительного процесса достаточно провести бактериологическое исследование, в других клинических ситуациях решающее значение имеют данные серологических исследований, в третьих, предоставить полезную информацию может только метод ПЦР. Однако наиболее часто в клинической практике врачу-клиницисту необходимо использовать данные различных методов лабораторных исследований.
Бактериологические методы исследования
Бактериологические исследования наиболее часто проводят при подозрении на гнойно-воспалительные заболевания (составляют 40-60% в структуре хирургических заболеваний) с целью их диагностики, изучения этиологической структуры, определения чувствительности возбудителей к антибактериальным препаратам. Результаты бактериологических анализов способствуют выбору наиболее эффективного препарата для антибактериальной терапии, своевременному проведению мероприятий для профилактики внутрибольничных инфекций.
Возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний являются истинно-патогенные бактерии, но наиболее часто условно-патогенные микроорганизмы, входящие в состав естественной микрофлоры человека или попадающие в организм извне. Истинно-патогенные бактерии в большинстве случаев способствуют развитию инфекционного заболевания у любого здорового человека. Условно-патогенные микроорганизмы вызывают заболевания преимущественно у людей с нарушенным иммунитетом.
Бактериологические исследования при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, направлены на выделение всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале, что существенно отличает их от аналогичных исследований при заболеваниях, вызванных истинно патогенными микроорганизмами, когда проводится поиск определенного возбудителя.
Для получения адекватных результатов бактериологического исследования при гнойно-воспалительных заболеваниях особенно важно соблюдать ряд требований при взятии биоматериала для анализа, его транспортировки в лабораторию, проведения исследования и оценки его результатов.
Для идентификации вида возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний и определения чувствительности к антибактериальным препаратам бактериологические лаборатории используют комплекс методов. Они включают:
- микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) из доставленного биоматериала;
- выращивание культуры микроорганизмов (культивирование);
- идентификацию бактерий;
- определение чувствительности к антимикробным препаратам и оценку результатов исследования.
Доставленный в бактериологическую лабораторию биоматериал первоначально подвергается микроскопическому исследованию.
Микроскопическое исследование мазка (бактериоскопия) , окрашенного по Граму или другими красителями, проводят при исследовании мокроты, гноя, отделяемого из ран, слизистых оболочек (мазок из цервикального канала, зева, носа, глаза и т.д.). Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характере микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различных видом микроорганизмов в биологическом материале, а также дает предварительную информации об обнаружении этиологически значимого инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу начать лечение (эмпирическое). Иногда микроскопия позволяет выявить микроорганизмы, плохо растущие на питательных средах. На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред для выращивания микробов, обнаруженных в мазке.
Культивирование микроорганизмов. Посев исследуемого биоматериала на питательные среды производят с целью выделения чистых культур микроорганизмов, установления их вида и определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этих целей используют различные питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов микроорганизмов. Оптимальными являются питательные среды, содержащие кровь животного или человека, а также сахарный бульон, среды для анаэробов. Одновременно производят посев на дифференциально-диагностические и селективные (предназначенные для определенного вида микроорганизмов) среды. Посев осуществляют на стерильные чашки Петри, в которые предварительно заливают питательную среду для роста микроорганизмов.
Микроскопия мазков, окрашенных по Граму
1 - стрептококки; 2 - стафилококки; 3 - диплобактерии Фридленда; 4 - пневмококки
Чашки Петри с посевами инкубируют в термостате при определенных температурных, а для ряда микроорганизмов газовых (например, для выращивания анаэробов создают условия с низким содержанием кислорода) режимах в течение 18-24 ч. Затем чашки Петри просматривают. Количественную обсемененность доставленного биоматериала микрофлорой определяют по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл или 1 мг исследуемого образца. При просмотре чашек Петри выявляют некоторые особенности изменения цвета среды, ее просветления в процессе роста культуры. Многие группы бактерий образуют характерные формы колоний, выделяют пигменты, которые окрашивают колонии или среду вокруг них. Из каждой колонии делают мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Оценивают однородность бактерий, форму и размер, наличие спор или других включений, капсулы, расположение бактерий, отношение к окраске по Граму. Вся эта информация служит важнейшей составляющей для выбора сред и получения в дальнейшем чистой культуры каждого микроорганизма.
Колонии отсевают на плотные, жидкие, полужидкие питательные среды, оптимальные для культивирования определенного вида бактерий.
Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейшему изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических, ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях, характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта.
Идентификация - это комплекс бактериологических методов изучения бактерий, позволяющий определить вид микроорганизма. В Лаборатории «Ситилаб» идентификация большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства. На бланке результата исследования в виде наименования микроорганизма или его рода, например, Streptococcus pneumoniae (пневмококк) или Eschrichia coli (кишечная палочка).
Определение чувствительности к антибактериальным препаратам. Чувствительность к антимикробным препаратам изучают у выделенных чистых культур микроорганизмов имеющих этиологическое значение для данного заболевания. Поэтому в направлении на бактериологические анализы требуется указать диагноз заболевания у больного. Определение чувствительности бактерий к спектру антибиотиков помогает лечащему врачу правильно выбрать препарат для лечения больного.
В Лаборатории «Ситилаб» определение чувствительности выделенной чистой культуры большинства видов бактерий и грибов осуществляется на автоматическом бактериологическом анализаторе с использованием диагностических панелей зарубежного производства к широкому спектру современных антибактериальных препаратов (от 6 до 32 препаратов, в зависимости от выделенного микроорганизма) с определением минимальной ингибирующей концентрации (МИК). На бланке результатов определения чувствительности к антибактериальным препаратам обозначение R - указывает на резистентность, I - умеренную чувствительность, S - чувствительность микроорганизма к данному препарату.
Оценка результатов исследования. Принадлежность условно-патогенных микроорганизмов к естественной микрофлоре организма человека создает ряд трудностей при оценке их этиологической роли в развитии гнойно-воспалительных заболеваний. Условно-патогенные микроорганизмы могут представлять нормальную микрофлору исследуемых жидкостей и тканей или контаминировать их из окружающей среды. Поэтому для правильной оценки результатов бактериологических исследований необходимо знать состав естественной микрофлоры изучаемого образца. В тех случаях, когда исследуемый биоматериал в норме стерилен, как, например, спинномозговая жидкость, экссудаты, все выделенные из него микроорганизмы могут считаться возбудителями заболевания. В тех случаях, когда исследуемый материал имеет собственную микрофлору, как, например, отделяемое влагалища, кал, мокрота, нужно учитывать изменения ее качественного и количественного состава, появление несвойственных ему видов бактерий, количественную обсемененность биоматериала. Так, например, при бактериологическом исследовании мочи степень бактериурии (число бактерий в 1 мл мочи), равная и выше 10 5 , свидетельствует об инфекции мочевых путей. Более низкая степень бактериурии встречается у здоровых людей и является следствием загрязнения мочи естественной микрофлорой мочевых путей.
Установить этиологическую роль условно-патогенной микрофлоры помогают также нарастание количества и повторность выделения бактерий одного вида от больного в процессе заболевания.
Врач-клиницист должен знать, что положительный результат бактериологического исследования в отношении биологического материала, полученного из в норме стерильного очага (кровь, плевральная жидкость, спинномозговая жидкость, пунктат органа или ткани), всегда тревожный результат, требующий немедленных действий по оказанию медицинской помощи.
Серологические методы исследования
В основе всех серологических реакций лежит взаимодействие антигена и антитела. Серологические реакции используются в двух направлениях.
1. Обнаружение с диагностической целью антител в сыворотке крови обследуемого. В этом случае из двух компонентов реакции (антитело, антиген) неизвестным является сыворотка крови, так как постановка реакции проводится с заведомо известными антигенами. Положительный результат реакции свидетельствует о наличии в крови антител, гомологичных применяемому антигену; отрицательный результат указывает на отсутствие таковых. Достоверные результаты получают при исследовании «парных» сывороток крови больного, взятой в начале заболевания (3-7-й день) и через 10-12 дней. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания антител. При вирусных инфекциях лишь четырехкратное и большее повышение титра антител во второй сыворотке имеет диагностическое значение.
С внедрением в практику лабораторий метода иммуноферментного анализа (ИФА) стало возможным определять в крови больных антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG), что существенным образом повысило информативность серологических методов диагностики. При первичном иммунном ответе, когда иммунная система человека взаимодействует с инфекционным агентов в первый раз, синтезируются преимущественно антитела, относящиеся к иммуноглобулинам класса М. Лишь позднее, на 8-12 день после попадания антигена в организм, в крови начинают накапливаться антитела иммуноглобулинов класса G. При иммунном ответе на инфекционные агенты вырабатываются также и антитела класса А (IgA), которые играют важную роль в защите от инфекционных агентов кожи и слизистых оболочек.
2. Установление родовой и видовой принадлежности микроба или вируса. В этом случае неизвестным компонентом реакции является антиген. Такое исследование требует постановки реакции с заведомо известными иммунными сыворотками.
Серологические исследования не обладают 100 % чувствительностью и специфич-ностью в отношении диагностики инфекционных заболеваний, могут давать перекрестные реакции с антителами, направленными к антигенам других возбудителей. В связи с этим оценивать результаты серологических исследований необходимо с большой осторожностью и учетом клинической картины заболевания. Именно этим обусловлено использование для диагностики одной инфекции множества тестов, а также применение метода Western-blot для подтверждения результатов скрининговых методов.
В последние годы прогресс в области серологических исследований связан с разработкой тест-систем для определения авидности специфических антител к возбудителям различных инфекционных заболеваний.
Авидность - характеристика прочности связи специфических антител с соответствующими антигенами. В ходе иммунного ответа организма на проникновение инфекционного агента стимулированный клон лимфоцитов начинает вырабатывать сначала специфические IgM-антитела, а несколько позже и специфические IgG-антитела. IgG-антитела обладают поначалу низкой авидностью, то есть достаточно слабо связывают антиген. Затем развитие иммунного процесса постепенно (это могут быть недели или месяцы) идет в сторону синтеза лимфоцитами высокоспецифичных (высокоавидных) IgG-антител, более прочно связывающихся с соответствующими антигенами. На основании этих закономерностей иммунного ответа организма в настоящее время разработаны тест-системы для определения авидности специфических IgG-антител при различных инфекционных заболеваниях. Высокая авидность специфических IgG-антител позволяет исключить недавнее первичное инфицирование и тем самым с помощью серологических методов установить период инфицирования пациента. В клинической практике наиболее широкое распространение нашло определение авидности антител класса IgG при токсоплазмозе и цитомегаловирусной инфекции, что дает дополнительную информацию, полезную в диагностическом и прогностическом плане при подозрении на эти инфекции, в особенности при беременности или планировании беременности.
Метод полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется. Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.
В ПЦР может быть использован различный биологический материал - сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.
Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:
- возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в т.ч. и материале, получаемом при биопсии;
- возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;
- возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);
- высокая чувствительность метода; например чувствительность ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4,0 . 10 2 копий/мл), в то время как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов - 2,1 пг/мл (приблизительно 7,0 . 10 5 копий/мл).
