Подсчет эритроцитов. Подсчет количества эритроцитов и клиническая оценка результатов

Для работы необходим ы: скарификаторы, ватные шарики, спирт, эфир, счетная камера Горяева, смеситель (меланжер) для подсчета эритроцитов, 3% раствор натрия хлорида, микроскоп. Объект исследования – человек.

Проведение работы : Счетную камеру помещают под микроскопом и рассматривают сетку Горяева вначале при малом, а затем при большом увеличении. Накрывают камеру покровным стеклом, притирая его края к стеклу камеры до появления радужных колец Ньютона. Оставив камеру под микроскопом, прокалывают палец ранее описанным методом. Первую выступившую каплю крови из пальца стирают ватным тампоном. Во вторую каплю погружают кончик смесителя для эритроцитов, держат его вертикально и набирают кровь до отметки 0,5, следя, чтобы в капилляр не попали пузырьки воздуха. Обтирают конец капилляра фильтровальной бумагой и быстро, пока кровь не свернулась, переносят его в чашку с 3% раствором натрия хлорида, продолжая держать смеситель вертикально. Набирают раствор до метки 101 (т.е. разводят кровь в 200 раз), после чего смеситель переводят в горизонтальное положение и кладут на стол.

Для подсчета эритроцитов берут заполненный меланжер, зажимая нижний конец пальцем, снимают резиновую грушу и, зажав оба конца смесителя третьим и первым пальцами, в течение 1 мин перемешивают кровь. При этом эритроциты сморщиваются и становятся заметнее. Выпускают из смесителя на вату три капли, а четвертую наносят на среднюю площадку камеры у края покровного стекла. Капиллярными силами капля сама втягивается в покровное стекло и заполняет камеру. Излишек раствора крови стекает в желобок. Если на сетку попал воздух или на боковых площадках оказался излишек раствора, камеру следует промыть дистиллированной водой, высушить и заполнить снова. Заполненную камеру ставят под микроскоп и, если форменные элементы расположены равномерно (что является показателем хорошего перемешивания крови), приступают к подсчету. Считать эритроциты лучше при малом объективе (х8), используя при этом окуляр х15. Подсчитывают число эритроцитов в пяти больших квадратах (разделенных на 16 маленьких), расположенных по диагонали от верхнего левого квадрата вниз направо. Подсчет ведут в пределах маленького квадрата по рядам (от верхнего до нижнего). Во избежание двукратного подсчета клеток, лежащих на границе между малыми квадратами, применяют правило Егорова: « к данному квадрату относятся эритроциты, лежащие как внутри квадрата, так и на его левой и верхней границах; эритроциты, лежащие на правой и нижней границах, к данному квадрату не относятся». Подсчитав сумму эритроцитов в пяти больших квадратах (что составляет 80 маленьких), находят среднее арифметическое число эритроцитов в одном маленьком квадрате. Зная, что объем пространства камеры над одним маленьким квадратом равен 1/4000 мм 3 , умножают найденное число на 4000. Получают число эритроцитов в 1 мм 3 разведенной крови. Умножив на величину разведения (200), получают количество эритроцитов в 1 мм 3 цельной крови. Таким образом, формула для вычисления количества эритроцитов следующая: Х = (Э х 4000 х 200)/80, где х – искомое число эритроцитов в 1мм 3 цельной крови, Э – сумма эритроцитов в 80 маленьких квадратах, 80 – число маленьких квадратов, в которых произведен подсчет, 200- разбавление крови. Затем полученное число эритроцитов записывают в пересчете на 1 л крови, т.е. число миллионов эритроцитов, найденных в 1 мм 3 , умножают на 10 12 .

Оформление результатов и их оценка: Записать, сколько эритроцитов содержится в 1 л исследуемой крови. Сравнить полученные результаты с нормой. У взрослых этот показатель составляет 5,0х10 12 у мужчин, (3,9-4,5) х10 12 у женщин, (4,0-4,5) х10 12 у детей школьного возраста, (5,5-7,0) х10 12 у новорожденных в первые дни жизни.

Методика определения количества гемоглобина по методу Сали.

Для работы необходим ы: скарификаторы, ватные шарики, спирт, эфир, 4% раствор цитрата натрия, гемометр Сали, капилляр (с меткой 20 мм 3), стеклянная палочка и пипетка. Объект исследования – человек.

Проведение работы : Определение количества гемоглобина по Сали производят колориметрическим способом, основанном на следующем принципе: если исследуемый раствор путём разбавления довести до окраски, одинаковой со стандартным раствором, то концентрация растворённых веществ в обоих растворах будет одинакова, а количества веществ будут соотносится как их объёмы. Зная количества веществ в стандартном растворе (16,7%, что принято за 100% гемоглобина), легко вычислить его содержание в исследуемом растворе в относительных процентах. Гемометр Сали представляет собой штатив, задняя стенка которого сделана из матового стекла. В штатив вставлены три пробирки одинакового диаметра. Две крайние сверху запаяны и содержат раствор солянокислого гематина, средняя – градуирована и открыта. Она предназначена для исследуемой крови. В среднюю пробирку гемометра наливают 0,1 N раствор HCL до нижней кольцевой метки. Затем из пальца обычным способом набирают кровь в капилляр до метки, удаляя излишек путём прикладывания фильтровальной бумаги к кончику капилляра. Выдувают кровь на дно средней пробирки так, чтобы верхний слой соляной кислоты оставался неокрашенным. Не вынимая пипетки, ополаскивают её соляной кислотой из верхнего слоя. После этого содержимое пробирки перемешивают, ударяя пальцем по её дну, и оставляют стоять 5-10 мин. Это время необходимо для полного превращения гемоглобина в солянокислый гематин. Затем к раствору прибавляют по каплям дистиллированнную воду до тех пор, пока цвет полученного раствора не будет одинаков с цветом стандартного (добавляяя воду, раствор перемешивают стеклянной палочкой). Цифра, стоящая на уровне нижнего мениска полученного раствора, показывает содержание гемоглобина в исследуемой крови в грамм-процентах. Можно вычислить относительное содержание гемоглобина в исследуемой крови, например, следующим образом. Допустим, в крови 14 г% гемоглобина, тогда 16,7г % составляет 100%, а 14,0 г% - х. Таким образом, х = 83,9%, что является показателем относительного содержания гемоглобина.

Взятие крови можно производить меланжерным (в меланжеры или смесители) или пробирочным методом (в пробирки, по Н.М.Николаеву) с последующим подсчетом количества эритроцитов в крови счетной камере под микроскопом. Подсчитывают эритроциты в крови и в фотоэлектрическом эритрогемометре, а также с помощью целлоскопа. В качестве разводящего раствора чаще всего используется изотонический раствор хлорида натрия.

Количество эритроцитов в крови - как рассчитать?

Наиболее распространенным является метод подсчета количества эритроцитов в камерах Бюркера с сеткой Горяева. Для этого кровь из пальца набирают в меланжер до метки 0,5, затем физиологическим раствором хлорида натрия доводят до метки 100 (разведение в 200 раз). Полученную взвесь эритроцитов в крови тщательно перемешивают, покручивая меланжер, затем ею заполняют камеру, подсчитывают количество эритроцитов в пяти больших квадратах сетки Горяева и к полученной цифре добавляют четыре нуля. Нормальное количество эритроцитов у женщин в крови 3,8 x 10 12 – 5,5 х 10 12 /л, у мужчин 4,5 х 10 12 – 5,0 х 10 12 /л.

Индексы красной крови – это среднее количество гемоглобина в одном эритроците и цветовой показатель. Определение среднего количества гемоглобина в одном эритроците в крови производят делением концентрации гемоглобина на число эритроцитов в 1 мкл. В норме 1 эритроцит содержит 33х 10 -8 мкг, или 33 пг гемоглобина (1 пг = 1х10 -12 г). Допускаются колебания от 27 до 33,4 пг.

Величину 33 пг, составляющую норму содержания гемоглобина в одном эритроците, условно принимают за единицу и обозначают как цветовой показатель. По цветовому показателю судят о том, является ли содержание гемоглобина в эритроцитах исследуемого лица нормальным, пониженным или повышенным по отношению к норме. Гиперхромия, т.е. увеличение среднего содержания гемоглобина в одном эритроците, дающее цветовой показатель выше единицы, зависит исключительно от увеличения объема эритроцитов, а не от повышенного насыщения их гемоглобином. Перенасыщения гемоглобином не бывает, нормальный эритроцит насыщен им до предела. На практике вычисление цветового показателя производят по формуле:

ЦП = 3 x гемоглобин (в г/л) / три первые цифры числа эритроцитов в миллионах

В норме цветовой показатель колеблется от 0,85 до 1,15.

Определение гематокритного числа эритроцитов в крови

Определение гематокритного числа в крови дает представление о соотношении между объемом форменных элементов и объемом плазмы. Гематокритное число в крови определяется методом центрифугирования крови в градуированных гематокритных трубках, капиллярах или путем расчета в автоанализаторах. Гематокрит – это два коротких стеклянных градуированных на 100 делений капилляра с диаметром просвета около 1 мм в специальной насадке, которая крепится на вертикальном валу двигателя центрифуги.

Капилляры предварительно обрабатываются антикоагулянтом. Затем в них насасывают венозную или капиллярную кровь и центрифугируют в стандартных условиях, либо в обычных центрифугах со скоростью 3000 об/мин, либо в специальных центрифугах при 16 500 об/мин в течении 1 мин. Форменные элементы крови, как имеющие больший удельный вес, под влиянием центробежной силы оседают у дистального конца капилляра.

Нормальные величины гематокритного числа у мужчин колеблются в пределах 40/60 – 48/52 или 40 – 48%, у женщин 36/64 – 42/58 или 36 – 42%,

Увеличение клеточной массы крови называется полицитемией, а уменьшение – олигоцитемией.

Определение диаметра эритроцитов в крови

Измерение диаметра эритроцитов в крови и графическую регистрацию распределения эритроцитов в крови по величине (эритроцитометрическая кривая, кривая Прайса – Джонса) можно производить с помощью прямых микроскопических и электронно-автоматических методов. Прямой микроскопический метод измерения диаметра эритроцитов чрезвычайно трудоемок и поэтому лучше пользоваться электронно -автоматическим методом.

Эритроцитометрическая кривая Прайса – Джонса в норме правильной формы с вершиной («пиком») на 7,2 мкм и довольно узким основанием в пределах 6 – 9 мкм.

Определение осмотической резистентности эритроцитов в крови

Принцип метода состоит в том, что эритроциты в гипертонических солевых растворах сморщиваются, а в гипотонических набухают. При значительном набухании наступает гемолиз. В пробирки с раствором хлорида натрия различной концентрации (от 0,70 до 0,22 %) вносят один и тот же объем крови (0,02 мм).

Через час пробирки центрифугируют и определяют начало гемолиза по легкому порозовению раствора, а полный гемолиз – по интенсивной красно-лаковой окраске раствора. В норме минимальная резистентность у взрослых людей колеблется между 0,40 и 0,46% хлорида натрия, максимальная – между 0,34 – 0,32 % хлорида натрия.

Определение количества ретикулоцитов – молодых эритроцитов в крови

Количество ретикулоцитов в крови по выходе из костного мозга в периферическую кровь в течение 6 ч превращается в зрелый эритроцит. Количество молодых эритроцитов подсчитывают в мазках крови, прижизненно окрашенных 1%-ным раствором бриллианткрезилблау. Для этого на предметное стекло с раствором бриллианткрезилблау наносят каплю крови и готовят мазок. Этот мазок помещают во влажную камеру на 10 мин. После этого его подсушивают на воздухе и считают количество ретикулоцитов в крови под иммерсионным объективом по отношению к 1000 эритроцитов. Результаты исследования выражают в промилле (%о). В норме содержание их в периферической крови составляет 2 – 10%о.

Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) в крови

За пределами кровеносного русла (если предотвращено свертывание крови) клетки крови оседают (седементируют), оставляя сверху слой плазмы. Этот феномен лежит в основе определения скорости оседания эритроцитов (СОЭ) в крови, которая выражается в миллиметрах плазмы, отстаивающейся в течение часа. Оседанию эритроцитов предшествует их агрегация типа монетных столбиков. От того, как происходит их формирование, и зависит СОЭ.

Наиболее распространен микрометод определения СОЭ в модификации Панченкова. Для этого используют специальные градуированные капиллярные пипетки, имеющие просвет в 1 мм и длину 100 мм. Пипетку предварительно промывают антикоагулянтом – 3,7%-ным раствором цитрата натрия. Затем набирают в нее этот раствор до метки «Р» и выливают в видалевскую пробирку. Далее той же капиллярной пипеткой из пальца набирают два раза кровь до метки «К» и выливают ее каждый раз в ту же пробирку.

Хорошо смешав, насасывают смесь в пипетку до отметки «О», отмечают время и ставят ее в штатив. Через час отсчитывают по делениям на капиллярной пипетке величину отстоявшегося столбика плазмы. Записывают величину СОЭ в миллиметрах в час. В норме у женщин она составляет до 14 – 15 мм в час, у мужчин – до 10 мм в час. СОЭ увеличивается у женщин во время беременности (после 3-го месяца) и остается повышенной около трех недель после родов (что зависит от увеличения объема плазмы, повышения содержания в крови глобулинов, холестерина и уменьшения содержания кальция), во время менструации (умеренно). Ускорение оседания эритроцитов наблюдается при сухоедении и голодании.

Принцип . Подсчет количества эритроцитов под микроскопом в определенном количестве квадратов счетной камеры и пересчет на 1 мкл или 1 л крови в соответствии с объемом и разведением крови.

Реактивы :

• разводящая жидкость - 0,9% раствор натрия хлорида или раствор Гайема: хлорид ртути II (HgCl 2) - 0,5 г;
• натрия сульфат (Na 2 SO 4) - 5 г;
• натрия хлорид - 1 г;
• вода дистиллированная - до 200 мл.

Ход определения . Исследуемую кровь необходимо развести в 200 раз. Для этого в пробирку наливают 4 мл разводящей жидкости. В пипетку набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей, кровь выдувают на дно пробирки, а пипетку промывают верхним слоем жидкости, повторно набирая и выдувая ее в пробирку (пипетируя). Содержимое пробирки перемешивают и оставляют до исследования. Эритроциты рекомендуется считать с помощью счетной камеры не позднее 3 ч после взятия крови.

Устройство и подготовка к работе счетной камеры Горяева. Счетная камера Горяева (далее - камера) представляет собой толстое, прозрачное, прямоугольное стекло с двумя сетками, выгравированными на его поверхности. На боковых участках стекла нанесены основные показатели и название камеры. Сетки отделены друг от друга поперечной канавкой, что препятствует затеканию жидкости из одной сетки в другую при ее заполнении. Двумя глубокими продольными канавками сетки отделены от стеклянных прямоугольных пластинок, к которым притираются шлифованные покровные стекла. Поверхность этих пластинок находится на 0,1 мм выше участков камеры, на которые нанесена сетка. Сетка камеры Горяева образована системой разграничительных линий, проведенных взаимно перпендикулярно. Она состоит из 3600 малых квадратов, сторона которых равна 0,05 (1/20) мм; высота камеры, создающаяся при притирании шлифованного покровного стекла, составляет 0,1 мм; площадь - 1/400 мм 2 ; объем - 1/4000 мм 3 (мкл); и 225 больших квадратов со стороной 1/5 мм; площадью 1/25 мм 2 и объемом 1/250 мм 3 (мкл). Длина стороны всей сетки составляет 3 мм, площадь - 9 мм 2 , объем - 0,9 мм 3 (мкл).

Камеру перед работой тщательно моют водой, вытирают насухо; так же подготавливают шлифованное покровное стекло. Камеру Горяева берут в руку. На участок камеры, где нанесена сетка, укладывают шлифованное покровное стекло. Затем стекло берут и другой рукой, при этом нижняя поверхность камеры находится на двух средних пальцах, два вторых пальца придерживают ее спереди. Свободными двумя первыми пальцами притирают шлифованное покровное стекло, плавно продвигая его по поверхности прямоугольных стеклянных пластинок до появления цветных колец Ньютона в местах плотного прилегания (притирания) покровного стекла к поверхности прямоугольных пластинок камеры (это свидетельствует о высоте камеры - 0,1 мм).

Заполнение камеры Горяева . Заполняют счетную камеру разведенной кровью, предварительно несколько раз встряхнув содержимое пробирки. Затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой с оплавленным концом отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к щели, образующейся между шлифованным стеклом (покровным) и счетной камерой, жидкость заполняет пространство над сеткой. Обычно одну из сеток заполняют для подсчета эритроцитов, другую - для подсчета лейкоцитов. При заполнении камеры следят за тем, чтобы в пространстве над сеткой не было пузырьков воздуха и жидкость не затекала в бороздки.

Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин для оседания эритроцитов.

Подсчет клеток. Не меняя горизонтального положения, камеру помещают на столик микроскопа и с помощью малого увеличения (объектив 8х, окуляр 10х) находят верхний (дальний) левый край сетки (для лучшего контрастирования опускают конденсор и прикрывают диафрагму). Считают эритроциты в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах, расположенных по диагонали сетки. Для того чтобы одни и те же эритроциты, лежащие на линиях, не попали в счет дважды, принято для каждого квадрата, кроме клеток, лежащих внутри квадрата, считать расположенные на двух определенных линиях (например, левой и верхней).

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят по формуле:

где X - число эритроцитов в 1 мкл крови; а - число сосчитанных эритроцитов; 200 - степень разведения крови; 80 - число просчитанных малых квадратов; 1/4000 - объем малого квадрата в мкл.

Причины ошибок .

1. Неточность при взятии крови в пипетку.
2. Неудовлетворительная градуировка пипеток.
3. Образование сгустка крови.
4. Неправильное притирание покровного стекла камеры или недостаточная его толщина (менее 0,3 мм).
5. Подсчет сразу после заполнения камеры, когда клетки еще не успели осесть на дно.
6. Плохо вымытые и недостаточно высушенные пипетки и пробирки.
7. Недоброкачественность реактивов, вызывающая гемолиз.
8. Любое отклонение от правил подготовки камеры, ее заполнения и подсчета клеток.

Примечание . При гемолитических анемиях, В12-дефицитной анемии подсчет эритроцитов следует осуществлять незамедлительно после взятия крови, так как они быстро разрушаются.

Методика автоматического подсчета эритроцитов

Осуществляется с помощью счетчиков и гематологических анализаторов, выпускаемых различными фирмами, например, Becman Coulter (Швейцария), Sysmex (Япония), Hoffman-La Roche (Швейцария), Serono (США) и др.

При работе с гематологическими счетчиками подготовка пробы (разведение) осуществляется вручную. При использовании гематологических анализаторов отбор пробы крови и ее обработка происходят без участия лаборанта.

Принцип работы большинства анализаторов основан на кондуктометрическом методе: определенное количество разведенной изотоническим раствором натрия хлорида или другого электролита крови пропускается через микроотверстие, проходящая через него клетка увеличивает сопротивление между электродами, и возникающий импульс передается на счетное устройство с цифровой индикацией.

Ход исследования выполняется в соответствии с инструкцией, прилагаемой к анализатору.

Нормальные величины . Количество эритроцитов в крови здорового человека, по данным А. И. Воробьева (1985), у мужчин составляет 4,0- 5,1 × 10 12 /л, у женщин - 3,7-4,7 × 10 12 /л.

Клиническое значение . Снижение количества эритроцитов (эритроцитопения) - один из основных критериев анемического синдрома. От истинной анемии необходимо отличать гидремию, связанную с увеличением объема плазмы за счет притока тканевой жидкости (например, при схождении отеков). Причинами анемий служат кровопотери, нарушения кроветворения в костном мозге (дефицит железа, фолиевой кислоты, витамина В12, апластические процессы) и повышенный гемолиз. Степень эритроцитопении варьируется и в тяжелых случаях (апластическая анемия, гемолитическая анемия в период криза, В12-дефицитная анемия) может достигать 1 × 10 12 /л и менее. Кроме этого, уменьшение количества эритроцитов наблюдается при лейкозах, множественной миеломе, неходжскинских лимфомах, системной красной волчанке, ревматоидном артрите, метастазах злокачественных опухолей и др., а также при недостаточном содержании белка в пище, голодании, вегетарианской диете.

Увеличение количества эритроцитов в единице объема крови называется полиглобулией или эритроцитозом. В физиологических условиях полиглобулия наблюдается у новорожденных первые 3 дня жизни (временное сгущение крови в результате потери жидкости организмом при внезапном переходе к легочному дыханию и кожной респирации), у взрослых - при усиленном потоотделении, голодании. При подъемах на большую высоту эритроцитоз обусловлен не сгущением крови, а действительным повышением продукции эритроцитов в связи с гипоксией. Эритроцитозы наблюдаются при патологических состояниях как симптомы целого ряда заболеваний (вторичные эритроцитозы). Вторичные симптоматические эритроцитозы делят на абсолютные и относительные. Причиной абсолютных полиглобулий является реактивное усиление эритропоэза с увеличением массы циркулирующих эритроцитов (при врожденных пороках сердца, хроническом обструктивном бронхите, гипернефроидном раке, гемангиобластоме мозжечка и др.). Сгущение крови без увеличения количества эритроцитов в результате уменьшения объема плазмы при длительной рвоте, диарее, ожогах лежит в основе относительных полиглобулий.

От симптоматических эритроцитозов следует отличать заболевания крови, относящиеся к гемобластозам и протекающие с увеличением количества эритроцитов, а порой лейкоцитов и тромбоцитов (истинная полицитемия).

Состав крови образован плазмой и форменными компонентами, большую часть из которых составляют эритроциты. Зрелые кровяные клетки не содержат ядра и имеют двояковогнутую форму. Главная их функция – транспортировка газов в тканях органов. Уровень эритроцитарных клеток в крови человека зависим от таких факторов, как пол и возраст, но является величиной достаточно постоянной, поэтому колебание их количества дает ценную информацию в процессе диагностирования.

Для вычисления количества кровяных клеток чаще всего используется унифицированный метод подсчета эритроцитов с использованием оборудования, известного, как камера Горяева, либо с помощью электронных счетчиков автоматического типа. Оба способа на данный момент широко используются и в ежедневной лабораторной практике, и при научных изысканиях, так как погрешность результатов, полученных в ходе их применения, минимальна.

Строение камеры Горяева

Оптическое устройство – камера Горяева позволяет вычислить количество кровяных клеток в определенном объёме специальной жидкости. Идея создания устройства принадлежит русскому профессору Горяеву Н. К.

Главный элемент устройства – прозрачное предметное стекло с камерой, образованной углублением в форме прямоугольника, поверхность которой покрыта специальной микроскопической сеткой, и тонкое покровное стекло. Высокая точность результатов подсчета достигается благодаря повышенному объёму сетки в сравнении с аналогичными устройствами других типов.

Сетка устройства имеет площадь 9 мм 2 , размер одной стороны составляет 3 мм. Поверхность данного элемента образована квадратами общим числом в 225 шт. Из них одна сотня квадратов поделена на прямоугольники, еще столько же – не разграфлено, а 25 штук поделены на 16 более маленьких. Площадь 1 малого квадрата составляет 1/400 мм 2 , область над ним имеет объём 1/4000 мм 3 .

Разбавление крови с целью исследования

Определение количества эритроцитов состоит из нескольких последовательных действий. Первым этапом становится разведение определенного объёма крови в реагенте. Делается это в связи с огромным числом форменных элементов.

В качестве реагента чаще всего выступает раствор хлорида натрия концентрацией 0,9%. При необходимости альтернативой служит 5% раствор натрия цитрата. Процедуру разбавления крови выполняют в пробирке или в специальном смесителе, называемом меланжером.

Внимание! Использование растворов с более высокой или низкой концентрацией исключено, так как повлечет за собой разрушение кровяных клеток.

Разбавление крови в меланжере

Меланжером называется изготовленный из стекла градуированный капилляр длинной 10 см с расширением на конце, внутри которого расположен шарик. Последний выполняет важную функцию – равномерное смешивание раствора и крови. Цвет шарика меланжерного капилляра будет красным, если он предназначен для эритроцитов, и белым – для работы с лейкоцитами.

Методика подсчета эритроцитов позволяет проводить процедуру исследования и со стабилизированной кровью, и с нестабилизированным материалом сразу после его забора у пациента.

Кровь набирают меланжерным капилляром до деления 0,5, после чего кончик смесителя очищают от крови с помощью марли либо ватки и следующим действием набирают разбавляющий раствор до деления 101. Перекрыв пальцами отверстия капилляра, полученный образец тщательно смешивают около 3 минут. В счётную камеру помещают четвёртую каплю, предварительно удалив первые три на марлю. Таким образом получают разбавление крови в 200 раз.

Разбавление крови в пробирке

При пробирочном методе разбавления крови исследуемый материал разводят в 200 раз следующим образом: 4 мл раствора хлорида натрия помещают в пробирку, после чего добавляют 0,02 мл крови.

Для этого забор материала производят пипеткой, кончик которой протирают ваткой или другой тканью. Образец крови помещают на дно пробирки, пипетку промывают ближе к поверхности раствором хлорида натрия. Готовый образец перемешивают и оставляют до дальнейшего этапа исследования, но менее чем на 3 часа.

Подсчет количества эритроцитов

Камера Горяева обязательно располагается горизонтально. Всю площадь сетки аккуратно заполняют разведенным образцом. Важно проследить, чтобы не образовались пузырьки воздуха, ведь их наличие значительно исказит результат. В таком положении камера остается в течение одной минуты с целью оседания кровяных клеток.

Унифицированный метод подсчета эритроцитов проходит при среднем увеличении посредством микроскопического осмотра. Подсчет числа эритроцитов в камере Горяева ведут в 5 больших квадратах, поделенных на 16 малых. Начало отсчета рекомендовано производить с большого квадрата, находящегося вверху слева, и далее по диагонали.

Важно! Чтобы количество клеток, находящихся на линиях малых квадратов, не было подсчитано дважды, рекомендуют пользоваться правилом Егорова: в каждом квадрате вести подсчет по двум определенным линиям (верхней и левой).

Правило Егорова

Начинают высчитывание клеток в малых квадратах в верхнем ряду слева направо от 1-го до 4-го в этом ряду. Переходя к следующему ряду, подсчет ведут в обратном порядке – справа налево. Переход к подсчету клеток в следующем большом квадрате производят после вычисления эритроцитов в этих 16 малых квадратах.

Непосредственно расчет числа эритроцитов ведут по формуле, отображенной на рисунке №2.

Формула расчета клеток

Обозначения в данной формуле расшифровываются следующим образом:

• X – искомое число красных кровяных клеток в 1 мкл крови;
• A обозначает количество сосчитанных клеток;
• 200 – разбавление крови;
• 80 – это количество малых посчитанных квадратов;
• 1/4000 – объем маленького квадрата.

Внимание! Для достоверности результата расчет кровяных клеток при некоторых видах анемии необходимо проводить непосредственно после забора материала.

Возможные причины искажения результата

Как и любой другой лабораторный анализ, подсчет эритроцитов требует тщательной подготовки и аккуратности в исполнении. Искажение результатов анализа может возникнуть вследствие целого ряда причин. Оборудование хранят в сухом месте. Любая лабораторная работа, связанная с кровью, выполняется в резиновых перчатках.

Для начала следует убедиться в правильности подготовки и использования камеры. Перед работой и по ее окончании устройство необходимо тщательно промывать дистиллированной водой и насухо протирать мягкой тканью. Покровное стекло должно быть подготовлено заблаговременно таким же образом.

Возможные причины, влияющие на достоверность результата:

• Некачественные реактивы, способные вызывать гемолиз.
• Формирование сгустка крови в материале.
• Неаккуратность в процессе забора крови в капилляр.
• Плохо обработанные пробирки и пипетки.
• Недобросовестная техника исполнения при работе с камерой и подсчете эритроцитов.
• Высчитывание клеток сразу же после заполнения камеры (необходимо выждать 1 минуту, чтобы они успели осесть на поверхность).

В последнее время все большую популярность получает метод подсчета эритроцитов с использованием электронных счетчиков автоматического типа. Такая тенденция вполне обоснованна, так как автоматизированный процесс исследования значительно точнее и менее трудоёмок.

Принцип действия данного оборудования основан на разном показателе электропроводности клеток крови и раствора, в котором они помещены. Специальное электромагнитное устройство регистрирует изменение уровня сопротивления электрической цепи, когда эритроциты движутся через отверстие капилляра. Уже через несколько секунд на цифровом табло высвечивается результат с высчитанным числом клеток.

Повышенный показатель красных кровяных клеток в анализе называется полицитемией. Данное состояние возникает вследствие патологий, характеризующихся потерей жидкости в организме, например при диарейном синдроме. Часто такое явление наблюдается на первых этапах инфекционных заболеваний, при отравлении токсичными веществами и прочем. Снижение же концентрации эритроцитов в крови известно как олигоцитемия. И зачастую такая патология проявляется во время различного вида анемии.

У человека и многих млекопитающих животных красные кровяные клетки, или эритроциты, представляют собой безъядерные клетки двояковогнутой формы (цвет. табл. II). Они эластичны, что помогает им проходить по узким капиллярам. Диаметр эритроцита человека 7-8 мкм, а толщина - 2-2,5 мкм. Отсутствие ядра и форма двояковогнутой линзы (поверхность двояковогнутой линзы в 1,6 раза больше поверхности шара) увеличивают поверхность эритроцитов, а также обеспечивают быструю и равномерную диффузию кислорода внутрь эритроцита.

Общая поверхность всех эритроцитов человека более 3000 м 2 , что в 1500 раз превышает поверхность его тела.

Общее количество эритроцитов, находящихся в крови человека, огромно. Оно примерно в 10 000 раз больше населения нашей планеты. Если выстроить все эритроциты человека в один ряд, то получилась бы цепочка длиной около 180 000 км; если же положить эритроциты один на другой, то образовалась бы колонна высотой, превосходящей длину экватора земного шара (50 000- 60 000 км).

В 1 мм 3 крови содержится от 4 000 000 до 5 000 000 эритроцитов (у женщин 4 000 000-4 500 000, у мужчин 4 500 000 - 5 000 000).

Количество эритроцитов не строго постоянно. Оно может значительно увеличиваться при недостатке кислорода на больших высотах, при мышечной работе. У людей, живущих в высокогорных районах, эритроцитов примерно на 30% больше, чем у жителей морского побережья. Не случайно, в первые дни пребывания в горной местности человек испытывает слабость, головокружение, снижается его работоспособность. Эти явления связаны с недостаточным поступлением в организм кислорода в условиях разреженного воздуха. Однако через некоторое время состояние человека значительно улучшается, так как в организме увеличивается количество эритроцитов, а следовательно, улучшается обеспечение его кислородом. При переезде из низменных районов в высокогорные количество эритроцитов в крови увеличивается. Когда же потребность в кислороде уменьшается, количество эритроцитов в крови снижается.

Подсчет эритроцитов

Подсчет эритроцитов производится при помощи специальных счетных камер.

Для подсчета форменных элементов взятую из пальца кровь разбавляют в специальных смесителях, чтобы создать нужную концентрацию клеток, удобную для счета. Для разбавления крови при подсчете эритроцитов применяют гипертонический (3-про-центный) раствор NaCl, в котором эритроциты сморщиваются.

Смеситель (меланжер) состоит из градуированной капиллярной трубочки с яйцевидным расширением (ампулой). В ампулу помещена стеклянная бусинка для лучшего размешивания крови (рис. 5). Имеются смесители для подсчета красных и белых кровяных телец. В смесителях для эритроцитов бусинка внутри ампулы окрашена в красный цвет, а для лейкоцитов - в белый. На капилляре смесителей имеются метки 0,5 и 1,0; они обозначают половину или целый объем капилляра. Выше яйцевидного расширения метка 101 в смесителе для эритроцитов означает, что полость расширения (ампулы) имеет объем в 100 раз больший, чем объем полости капилляра. На смесителе для лейкоцитов имеется метка И, свидетельствующая о том, что полость ампулы в 10 раз больше полного объема капилляра. Когда в смеситель для эритроцитов набирают кровь до метки 1,0, а затем разбавляют ее 3-процентным раствором NaCl, доводя общий объем до метки 101, кровь будет разведена в 100 раз. При разведении в 200 раз следует набрать кровь в капилляр смесителя до метки 0,5 и добавить разбавляющей жидкости до метки 101.

Перед употреблением смеситель должен быть тщательно вымыт, высушен продуванием воздуха с помощью водоструйного насоса или резиновой груши. Достаточно ли просушен смеситель, определяют по передвижению бусинки в ампуле: прилипание бусинки к стенкам свидетельствует о наличии влаги.

Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло, на верхней поверхности которого имеются три поперечные площадки, разделенные между собой углублениями (рис. 6). Средняя площадка ниже крайних на 0,1 мм, и при наложении на боковые площадки покровного стекла над сеткой средней площадки образуется камера глубиной 0,1 мм. Камера Горяева имеет на средней площадке поперечный желобок. По обе стороны от этого желобка находится квадратная сетка, нарезанная специальной делительной машиной. Сетка может иметь разный рисунок в зависимости от конструкции камеры. В сетке камеры Горяева имеется 225 больших квадратов, 25 из которых разделены на 16 маленьких квадратиков каждый. Размеры маленьких квадратиков в камере любой конструкции одинаковы. Сторона малого квадрата равна 1⁄20 мм, следовательно, его площадь 1⁄20 × 1⁄20 = 1⁄400 (мм 2). Если учесть, что высота камеры (расстояние от поверхности средней площадки до покровного стекла) равна 1⁄10 мм, то объем крови над малым квадратом равен: 1⁄400×1⁄10 = 1⁄4000 (мм 3).

Опыт 6

Налейте в чашечку раствор для разбавления крови (3-процентный раствор NaCl). Проколите иглой кожу пальца, первую выступившую из пальца каплю крови сотрите ватным тампоном и, когда на пальце появится капля крови достаточной величины, погрузите в нее кончик смесителя. Наконечник смесителя (4 на рис. 5) возьмите в рот и насосите кровь до метки 0,5, Надо следить, чтобы в капилляр не попали пузырьки воздуха. Для этого кончик капилляра должен быть погружен в каплю крови до конца насасывания. Нельзя прижимать смеситель к пальцу, чтобы не закупорить отверстие смесителя. Нужно стараться, чтобы кровь не поднималась выше указанной метки на смесителе, но если это случилось, то можно осторожно опустить кончик капилляра на вату или фильтровальную бумагу, и уровень крови опустится. Разумеется, ошибка при подсчете увеличится. Затем быстро погрузите кончик капилляра в разбавляющую жидкость (3-процентный раствор NaCl). He выпуская кровь из смесителя, насосите в него ртом разбавляющий раствор до метки 101. Кровь теперь будет разведена в 200 раз. Закончив набор жидкости, переведите смеситель в горизонтальное положение, снимите резиновую трубку, закройте капилляр с обоих концов большим и указательным пальцами и тщательно перемешайте жидкости в расширении смесителя. Теперь смеситель в горизонтальном положении опустите на стол.

Плотно притрите покровное стекло к крайним площадкам счетной камеры так, чтобы при опрокидывании камеры стекло не падало. Из смесителя выпустите 2-3 капли жидкости на вату или фильтровальную бумагу, а следующую каплю с кончика капилляра выпустите под покровное стекло в счетную камеру. Смесь жидкостей в силу капиллярности должна ее равномерно заполнить, а положение покровного стекла не должно измениться. Если стекло "всплывает", то камеру тщательно протрите и процедуру заполнения повторите. Заполненную камеру поместите под микроскоп.

При малом увеличении подсчитайте число эритроцитов в 80 маленьких квадратиках, что соответствует 5 большим часто разграфленным квадратам. 5 больших квадратов выбирайте по диагонали через всю счетную камеру. Это делается для того, чтобы уменьшить ошибку, связанную с неравномерностью заполнения камеры.

Чтобы облегчить подсчет эритроцитов, на листе бумаги нарисуйте 5 больших квадратов, каждый из них разделите на 16 маленьких квадратиков. Подсчитав под микроскопом число эритроцитов в каждом маленьком квадратике, впишите эту величину в квадратики на бумаге.

Для того чтобы не ошибиться в подсчете и дважды не подсчитать эритроциты, лежащие на границах между малыми квадратиками, пользуйтесь таким правилом: относящимися к данному квадрату считаются эритроциты, лежащие как внутри квадрата, так и на его левой и верхней границе. Эритроциты, лежащие на правой и нижней границе квадрата, не считаются.

Исходным для дальнейших расчетов принимают объем жидкости над одним малым квадратиком. Поскольку он равен 1⁄4000 мм 3 , то количество эритроцитов в 1 мм 3 крови можно подсчитать, умножив среднее количество эритроцитов в малом квадратике на 4000 и на величину разведения крови.

где Э - число эритроцитов в 1 мм 3 крови;

n - число эритроцитов, подсчитанное в 80 малых квадратиках;

200 - разведение крови.

Закончив подсчет эритроцитов, вымойте счетную камеру и вытрите ее насухо чистой марлей.

Значение эритроцитов в поддержании постоянства внутренней среды

Основная функция эритроцитов заключается в переносе кислорода от легких ко всем клеткам тела. Находящийся в эритроцитах гемоглобин легко соединяется с кислородом и легко отдает его в определенных условиях.

Велика роль эритроцитов и в удалении углекислого газа из тканей. При участии эритроцитов углекислый газ, образующийся в процессе жизнедеятельности клеток, превращается в углекислые соли, которые постоянно циркулируют в крови. В капиллярах легких эти соли, опять же при обязательном участии эритроцитов, распадаются с образованием углекислого газа и воды. Углекислый газ и часть воды тут же удаляются из организма через дыхательные пути.

Эритроциты поддерживают относительное постоянство газового состава крови. При нарушении их функции во внутренней среде организма резко повышается содержание углекислого газа и развивается кислородная недостаточность, что губительно сказывается на деятельности всего организма.

Гемоглобин

В составе эритроцитов содержится белковое вещество гемоглобин, придающее крови красный цвет. Гемоглобин состоит из белковой части - глобина - и небелкового вещества - гема, содержащего двухвалентное железо. В капиллярах легких гемоглобин соединяется с кислородом, образуя оксигемоглобин .

В капиллярах тканей оксигемоглобин легко распадается с освобождением кислорода и гемоглобина. Этому способствует высокое содержание в тканях углекислого газа.

Оксигемоглобин имеет ярко-красный цвет, а гемоглобин - темно-красный. Этим объясняется различие в окраске венозной и артериальной крови.

Оксигемоглобин обладает свойствами слабой кислоты, что имеет важное значение в поддержании постоянства реакции крови (рН).

Гемоглобин способен образовывать соединение и с углекислым газом. Этот процесс происходит в капиллярах тканей. В капиллярах легких, где содержание углекислого газа значительно меньше, чем в капиллярах тканей, соединение гемоглобина с углекислым газом распадается. Таким образом, гемоглобин переносит не только кислород от легких к тканям. Он участвует и в переносе углекислого газа.

Наиболее прочно гемоглобин соединяется с угарным газом (СО). При содержании в воздухе 0,1% угарного газа больше половины гемоглобина крови связывается с окисью углерода, в связи с чем клетки и ткани не обеспечиваются необходимым количеством кислорода. В результате кислородного голодания появляются мышечная слабость, судороги, происходит потеря сознания и может наступить смерть.

Первая помощь при отравлении угарным газом - обеспечить приток чистого воздуха, напоить пострадавшего крепким чаем, а дальше необходимо медицинское вмешательство.

В 100 мл крови человека содержится в среднем около 16 г гемоглобина.

Определение количества гемоглобина производится колориметрическим способом, основанным на следующем принципе: если исследуемый раствор путем разбавления довести до окраски, одинаковой со стандартным раствором, то концентрация растворенных веществ в обоих растворах будет одинакова, а количества веществ будут соотноситься как их объемы. Зная количество вещества в стандартном растворе, можно вычислить его содержание в исследуемом растворе. Прибор для определения количества гемоглобина в крови называют гемометром.

Гемометр (рис. 7) представляет собой штатив, задняя стенка которого сделана из стекла молочного цвета. В штатив вставлены три пробирки одинакового диаметра. Две крайние пробирки сверху запаяны и содержат стандартный раствор солянокислого гематина (соединение гемоглобина с соляной кислотой). Средняя пробирка градуирована и открыта сверху. Она предназначена для исследуемой крови. К прибору приложены пипетка на 20 мм 3 и тонкая стеклянная палочка. Раствор, взятый для стандарта, содержит в 100 мл 16,7 г гемоглобина. Такое содержание гемоглобина считается высшим пределом нормы и принимается за 100%. Для проведения исследования гемоглобин испытуемой крови нужно перевести в солянокислый гематин. Это вещество коричневого цвета, а стандартный раствор его имеет окраску крепкого чая.

Опыт 7

В среднюю пробирку гемометра налейте 0,1-нормального раствора соляной кислоты до метки 10. В специальную пипетку, прилагаемую к гемометру, наберите 20 мм 3 крови; обтерев кончик пипетки ваткой (уровень крови в ней при этом не должен меняться), осторожно выдуйте кровь на дно пробирки с соляной кислотой. Не вынимая из пробирки пипетку, несколько раз сполосните ее соляной кислотой. Наконец, прикоснитесь пипеткой к стенке пробирки и тщательно выдуйте ее содержимое. Раствор оставьте на 5-10 мин, перемешивая его стеклянной палочкой. Это время необходимо для полного превращения гемоглобина в солянокислый гематин.

Затем в среднюю пробирку по каплям приливайте пипеткой дистиллированную воду до тех пор, пока цвет полученного раствора не будет одинаковым с цветом стандарта (добавляя воду, раствор перемешивайте палочкой). Особенно осторожно добавляйте последние капли.

Цифра, стоящая на уровне поверхности раствора в средней пробирке, покажет содержание гемоглобина в исследуемой крови в процентах по отношению к норме, условно принятой за 100 %.

Реакция оседания эритроцитов (РОЭ)

Если кровь предохранить от свертывания и оставить на несколько часов в капиллярных трубочках, то эритроциты, находящиеся в крови, в силу тяжести начинают оседать. Они оседают с определенной скоростью. У женщин нормальная скорость оседания эритроцитов 7-12 мм в 1ч, а у мужчин - 3- 9 мм в 1 ч.

Определение скорости оседания эритроцитов имеет важное диагностическое значение в медицине. При туберкулезе, различных воспалительных процессах в организме скорость оседания эритроцитов повышается.

Реакцию оседания эритроцитов (РОЭ) определяют с помощью прибора Панченкова (рис. 8).

Прибор представляет собой штатив, в котором укреплены в вертикальном положении капиллярные трубочки. На капиллярах нанесены деления в миллиметрах. Кроме того, на каждом капилляре имеются еще три метки: метка К (кровь), метка Р (реактив) и метка О, которая стоит на одном уровне с меткой К.